|
改善反相HPLC中的峰拖尾
在反相HPLC中峰拖尾是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。特別是分離堿性化合物和通過(guò)HPLC分析藥物成分時(shí)是經(jīng)常產(chǎn)生拖尾緣由。但是用V型混合機(jī)是最好的辦法，峰拖尾可以引起分離度降低，靈敏度減弱，精密度和定量變差。圖1表明峰之間的分離度和靈敏度與峰拖尾成負(fù)相關(guān)。圖2表明準(zhǔn)確度和精密度因數(shù)據(jù)系統(tǒng)無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)而受到影響。
圖1 拖尾對(duì)分離度和靈敏度的影響
當(dāng)峰拖尾（T，拖尾因子）從1.0增加到2.0時(shí)，分離度（Rs）從1.5降到1.0。靈敏度（峰高）由于峰的體積增大和樣品的濃度降低而降低。
圖2 峰拖尾對(duì)準(zhǔn)確度和精密度的不利影響。
拖尾峰使數(shù)據(jù)系統(tǒng)難以準(zhǔn)確確定峰的終點(diǎn)，故而影響準(zhǔn)確度和精密度。在這個(gè)例子中，在B點(diǎn)測(cè)得到峰面積比在A點(diǎn)測(cè)得的峰面積少約3%。
峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：
1、 溶解樣品的溶劑比流動(dòng)像更強(qiáng)，
2、 樣品量過(guò)載，
3、 固定相中的硅醇基與胺類物質(zhì)相結(jié)合反應(yīng)，
4、 硅膠吸附酸性化合物，
5、 色譜柱柱床中有空隙。
只要確定了拖尾的原因就可以采取措施減少拖尾并消除之。（表1）
表1 峰拖尾：原因及解決方案
|
原因
|
解決方案
|
|
樣品溶劑極性強(qiáng)于流動(dòng)相
|
在流動(dòng)相中溶解樣品，盡可能降低樣品溶劑的強(qiáng)度
|
|
樣品量過(guò)載
|
減少進(jìn)樣量，參考表2中推薦的不同柱型對(duì)應(yīng)的不同進(jìn)樣體積
|
|
硅醇基與胺類物質(zhì)的結(jié)合
|
1.調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH<3.0。
2.增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，25mM～50mM。
3.流動(dòng)相中增加競(jìng)爭(zhēng)性的胺類，10mM的TEA（三乙胺）。
4.選擇低硅醇活性的固定相。參照?qǐng)D6 C18柱按固定相硅醇活性分級(jí)。
5.
|
|
酸性物質(zhì)在硅膠上的吸附
|
1. 增加流動(dòng)相中鹽的濃度，25mM～50mM。
2. 調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH<3.0
3. 增加競(jìng)爭(zhēng)性的有機(jī)酸，1%醋酸或者是0.1%TFA（三氟乙酸）
|
|
柱子空隙
|
更換新的色譜柱
嘗試填充空隙很少能達(dá)到較好的效果。
|
一、由于溶解樣品的溶劑極性強(qiáng)于流動(dòng)相而引起的拖尾
如果溶解樣品的溶劑極性強(qiáng)于流動(dòng)相，就會(huì)引起寬的甚至是拖尾的峰。有幾種線索可以幫助確定是由于此種原因引起的拖尾。第一種就是先流出的峰的拖尾較后流出的峰拖尾嚴(yán)重；另一種跡象就是進(jìn)樣量減少或者是樣品經(jīng)流動(dòng)相稀釋后進(jìn)樣峰拖尾減輕了。
如果懷疑拖尾的原因是流動(dòng)相的強(qiáng)度引起的，解決很簡(jiǎn)單。將樣品溶解在流動(dòng)相中，或者將樣品經(jīng)流動(dòng)相稀釋至進(jìn)樣后峰拖尾符合要求。
二、由樣品量過(guò)載引起的峰拖尾
當(dāng)進(jìn)樣量超過(guò)柱子的容量，樣品峰會(huì)呈現(xiàn)一個(gè)直角三角形。當(dāng)更多的樣品量注入時(shí)，峰的前端變得很尖而后端就拖尾更嚴(yán)重。另一個(gè)現(xiàn)象就是色譜柱過(guò)載后保留時(shí)間會(huì)隨樣品量的增加而提前。（見(jiàn)圖3）由樣品過(guò)載引起的峰拖尾的解決方案就是減少進(jìn)樣量。表2提供了各色譜柱的直徑及參考的最大進(jìn)樣量，表2還提供了進(jìn)樣量的范圍，因?yàn)閷?shí)際進(jìn)樣量依賴于柱子的填料（具有高的表面積的填充材料可以具有大的進(jìn)樣量），分析物質(zhì)（分子量大的進(jìn)樣量要少），和其他的因素比如樣品在流動(dòng)相中的溶解性。
圖3 樣品量過(guò)載引起的拖尾
樣品過(guò)載，峰的前端會(huì)變得尖銳，后端拖尾，保留時(shí)間會(huì)稍微提前。如果峰形看上去有點(diǎn)像直角三角形，那么可能就是過(guò)載了。
表2 HPLC色譜柱的參考最大進(jìn)樣量
|
柱直徑（mm）ID
|
參考最大樣品量（mg）
|
|
10
|
35-65
|
|
4.6
|
4.5-9.0
|
|
3.0
|
2.0-4.0
|
表3 反相HPLC常用緩沖液
|
緩沖液
|
pKa
|
緩沖液范圍
|
UV截止波長(zhǎng)（nm）
|
|
磷酸鹽
|
2.1
|
1.1～3.1
|
200
|
|
7.2
|
6.2～8.2
|
|
12.3
|
11.3～13.3
|
|
醋酸鹽
|
4.8
|
3.8～5.8
|
210
|
|
檸檬酸鹽
|
3.1
|
2.1～4.1
|
230
|
|
4.7
|
3.7～5.7
|
|
5.4
|
4.4～6.4
|
|
Tris（三羥甲基氨基甲烷）
|
8.3
|
7.3～9.3
|
205
|
|
三乙胺
|
11.0
|
10.0～12.0
|
200
|
三、由固定相中的硅醇基與胺類相互作用引起的拖尾
在反相HPLC中出現(xiàn)拖尾的另一個(gè)常見(jiàn)的原因是由于帶正電荷的溶液（胺類）與固定相顆粒表面上的酸性硅醇發(fā)生了離子交換而引起的二次保留(圖 4)，具有顯著的硅醇活性的固定相的色譜柱大部分都會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象，而且中性pH（6～8）條件下比在酸性pH（<3）更易發(fā)生。
酸性和中性的化合物一般不受影響，一些堿性化合物更易受到此效應(yīng)的影響。如果是因?yàn)楣璐嫉脑蛞鸬耐衔玻梢詮南旅鎺撞縼?lái)糾正拖尾的問(wèn)題。首先，確認(rèn)流動(dòng)相中有合適的緩沖鹽，可能的話盡量在pH<3的條件下操作。使用足夠的緩沖液控制pH并減少離子交換效應(yīng)。
在pH<3的條件下操作，可使硅膠固定相上的硅醇基質(zhì)子化，減少了溶質(zhì)與硅醇反應(yīng)的幾率。
圖4相互作用引起的峰拖尾
固定相表面的酸性硅醇基可以形成與堿性化合物反應(yīng)的離子交換位點(diǎn)，經(jīng)反相HPLC分離胺類化合物時(shí)，這種離子交換反應(yīng)常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。
另一種解決拖尾的方法是在流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)性的胺類，加到流動(dòng)相中的三乙胺（TEA）就是這個(gè)目的。TEA可以與硅醇發(fā)生強(qiáng)的反應(yīng)，并抑制樣品中的胺類與硅醇反應(yīng)。圖5是TEA如何提高峰形的例子，多數(shù)情況下，大約10mM的TEA足夠了。
有些色譜分析者反對(duì)向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)性的胺類，因?yàn)樵黾恿朔治龇椒ǖ膹?fù)雜性并且用一種不易逆轉(zhuǎn)的方法改變了色譜柱的性質(zhì)。強(qiáng)度胺類，像三乙胺，不易從色譜柱上洗脫下來(lái)。那意味著用過(guò)含有TEA的色譜柱就不再適合應(yīng)用于流動(dòng)相中不含TEA的分析。
圖5 向流動(dòng)相中加入TEA用來(lái)提高峰形
色譜柱：Eclipse XDB-C8 4.6*150mm
流動(dòng)相：85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN
流速：1.0ml/min
溫度：35℃
樣品：苯丙胺類
1. 苯丙醇胺
2. 麻黃堿
3. 苯丙胺
4. 甲基苯丙胺
5. 苯三胺
向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)性的胺類，三乙胺等，可以減少峰拖尾。三乙胺與硅醇強(qiáng)烈作用，減少了樣品混合物中胺類與硅醇的作用。阿米替林常用來(lái)檢測(cè)反相HPLC色譜柱的硅醇活性。下表根據(jù)阿米替林的對(duì)稱性（峰拖尾）對(duì)色譜柱進(jìn)行了分類。其中阿米替林具有較低的對(duì)稱性的柱子具有較低的硅醇活性，這些色譜柱是常常用來(lái)用反相HPLC分離胺類物質(zhì)的最好選擇。數(shù)據(jù)來(lái)源于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化研究所對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的分析認(rèn)證870“液相色譜用柱性能測(cè)試混合物”
使用三乙胺可以不用選擇低硅醇活性的固定相。圖6根據(jù)硅醇的活性分列出了常用的C18反相色譜柱，在圖6中的分類根據(jù)測(cè)定阿米替林的對(duì)稱性，一種胺類常用來(lái)測(cè)定固定相的硅醇活性。阿米替林在固定相中具有較低拖尾（低對(duì)稱值）時(shí)，該固定相就顯示較低的硅醇活性并且檢測(cè)堿性化合物時(shí)就會(huì)有較低的拖尾。
圖6 根據(jù)硅醇活性排列的常用C18柱
色譜柱：4.6×150mm，5um
流動(dòng)相：80%甲醇20%0.05M磷酸鹽緩沖液pH7
流速：2.0ml/min
溫度：24℃
樣品：阿米替林
四、酸性化合物在硅膠上吸附引起的拖尾
雖然較胺類引起的拖尾少，酸類物質(zhì)有時(shí)候引起峰的展寬和拖尾主要由于硅膠固定相的吸附。糾正因?yàn)榇祟愒蛞鸬耐衔簿蛻?yīng)提高流動(dòng)相中鹽的濃度來(lái)抑制二次反應(yīng)，降低流動(dòng)相的pH使硅醇和溶質(zhì)質(zhì)子化，必要時(shí)可以向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)性的酸（圖7）。
圖7 酸性化合物引起的峰拖尾通常可以向流動(dòng)相中加入酸來(lái)改善
色譜柱：4.6×150mm，C18
流動(dòng)相：40%5mMNaH2PO460ACN
樣品：布洛芬
布洛芬，酸性化合物，嚴(yán)重拖尾，向流動(dòng)相中加入乙酸可以改善。乙酸優(yōu)先和硅膠固定相表面的酸性硅醇基反應(yīng)，抑制了布洛芬和硅醇基的反應(yīng)，減低了拖尾。
五、由于柱床空隙引起的拖尾
色譜柱床的柱頭空隙可引起峰的展寬有時(shí)候會(huì)拖尾。雖然幾年前柱子有空隙非常普遍，生產(chǎn)商現(xiàn)在完善了填裝技術(shù)生產(chǎn)更高質(zhì)量的色譜柱，除非在極高的壓力或流速的條件下裝柱，很少色譜柱中有空隙，然而，如果通常色譜柱具有良好的柱效，突然發(fā)現(xiàn)所有的峰均拖尾時(shí)，可能是柱子有空隙。先洗脫出的峰較后洗脫的峰更易受柱空隙的影響。
雖然許多色譜分析者嘗試用相同的固定相材料修補(bǔ)柱子的空隙，就經(jīng)驗(yàn)來(lái)講，此法很少能達(dá)到預(yù)期的效果。由于柱子空隙引起的拖尾最好的解決方法就是換掉它，這樣可以節(jié)省時(shí)間，金錢，減少麻煩。
|
